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    新生兒溶血病檢測卡標準操作程序
    來源:博迅生物    發布時間:2009年11月21日

    一、準備工作

    (一)微柱凝膠試劑卡的準備:觀察外觀,如有干膠、雜質、氣泡不可使用,之后將卡放置

    室溫(18-25℃)平衡,再用專用離心機離心5分鐘。

    (二)試劑的制備:6%牛血清白蛋白(鹽水稀釋)

    (三)標本采集:采集被檢對象靜脈血,將該同一人血液分別制備成紅細胞標本和血清標本。

    (四)紅細胞標本的制備:用紅細胞稀釋液配制紅細胞懸液,紅細胞最終濃度為0.8%。

    (五)血清標本的制備:將被檢者靜脈血采入含兔腦粉或其它促凝劑的試管中,10分鐘后離

    心,取上清;或者將被檢者靜脈血采入無抗凝劑試管中,4℃放置12小時,或37℃放置

    2小時后離心,2000rpm,10分鐘,取上清。該上清不得有絮狀物或沉淀。

    (六)熱放散:充分洗滌紅細胞至少三次,取同體積洗滌后的壓積血和6%牛血清白蛋白混勻,

    置于56℃孵育10分鐘,期間不斷搖動,離心3000rpm,2-3分鐘,取上清。即放散液。

    (七)酸放散:

    1、取直接抗人球蛋白試驗(DAT)陽性待檢血樣(或在體外已吸收血清的紅細胞),離心盡

    可能去除血或血漿。

    2、用生理鹽水洗滌待檢紅細胞4次,以除去未結合的抗體,留取約1ml的最后一次洗滌液。

    3、配制酸放散液:取4體積的放散液A與1體積的放散液B混合均勻。

    4、將1ml待檢壓積紅細胞與1ml酸放散液混合均勻,室溫孵育1-2分鐘。

    5、以3000rpm離心1分鐘。

    6、立即將酸放散液移到另一支干凈試管中,并加入紫紅色中和液調顏色至肉色或水粉色

    (500ul放散液加入中和液60-80ul),此時PH值近中性。以3000rpm離心1-2分鐘,

    取上清即放散液。

    7、放散液與最后一次洗滌液做平行檢測。

    8、用試管法或微柱凝膠抗人球蛋白卡檢測,出現陰性反應,則需要加入人IgG致敏的紅細胞

    做確認試驗,以保證抗人球蛋白試劑的有效性。

    二、實驗步驟

    1、取新生兒的紅細胞0.8%懸液50ul分別加入新生兒ABO、RhD血型檢測卡(微柱凝膠)卡的

    1-6孔中。

    2、使用專用離心機離心5分鐘(900rpm 2分鐘,1500 rpm 3分鐘)。

    3、取出,判讀結果。

    4、新生兒卡Ⅱ1-3孔分別加入50ul新生兒血清,4-6孔分別加入50ul新生兒紅細胞放散液。

    5、將A型紅細胞懸液50ul分別加入第1、4孔;將B型紅細胞懸液50ul分別加入第2、5孔;

    將O型紅細胞懸液50ul分別加入第3、6孔中。

    6、37℃孵育15分鐘。

    7、取出,使用專用離心機離心5分鐘(900rpm2分鐘,1500 rpm3分鐘),取出,判讀結果。

    三、結果判定

    陽性結果:紅細胞凝集塊位于凝膠表面或凝膠中。表明被檢者血清中含有對應其抗原的抗體

    或血細胞被致敏。

    陰性結果:紅細胞完全沉降到凝膠底部,在凝膠管底部形成紅細胞扣。表明血清中無相應抗

    原免疫的抗體或血細胞沒有被致敏。

    反應強度:特異性紅細胞抗原抗體復合物位于膠表面,為強陽性反應;復合物在膠中為弱陽

    性反應;愈靠近膠底部顆粒愈小,反應愈弱(2+或1+)。

    直抗試驗以出現凝集為陽性,游離和放散試驗均以檢出可以和新生兒紅細胞反應的抗體

    為陽性。

    四、注意事項

    1、紅細胞標本一定不能被細菌污染,否則出現假陽性反應。盡可能應用當日采集的新鮮血做

    本實驗。如不得不用過夜血或陳舊血,則必須首先用該標本做陰性對照試驗,以確定該標

    本是否可以做本實驗。

    2、血清標本:血清標本必須充分去除纖維蛋白,否則標本中纖維蛋白在微柱凝膠中析出,阻

    礙紅細胞沉淀,呈假陽性反應。

    3、如在微柱凝膠中出現溶血現象,強烈提示為紅細胞抗原抗體陽性反應,也不排除其他原因

    所致溶血,故對此標本一定認真分析,并向上級主管技術人員多報告并討論。

    4、父親紅細胞標本也可用與其同型的A型或B型紅細胞代替。

    5、洗出盡量多紅細胞進行放散;注意放散的溫度不可超過56℃,以防溶血;天冷時放散液注

    意保溫;吸出盡可能多的放散液;注意除去放散液中殘留的紅細胞;放散前紅細胞要充分

    洗滌,至少三次。

    6、每日試驗前,先取出微柱凝膠卡放置至室溫。

    7、試劑卡應放在18-25℃儲存,如若長期放在4℃冰箱,建議每1-2個月取出,用專用離心機

    離心一次,以防止干膠或產生氣泡。

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